NGS一直是诊断领域的热点，但由于各种原因，除产前诊断NGS以外，其他应用一直未获得国家行政机关的认可，包括在美国，获得FDA批准的NGS项目也屈指可数。
为此，定向点金曾在今年一月份就这一热点问题邀请了美国FDA前NGS负责人Dr. Elizabeth Mansfield、核准审批Illumina MiSeq的主要负责人Dr. Cheng Zhang，卫健委临检中心副主任李金明教授、中检所黄杰教授等在海南三亚召开了“2018二代测序中美高峰论坛”，对当前的NGS产品研发、注册、审批等方面进行了探讨。【2018中美高通量测序与管理高峰论坛】
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近日，国家药监局先后批准了两家企业的肿瘤NGS产品上市，使得NGS技术在临床诊断领域的应用得以进一步推广，为此，定向点金特将相关内容为大家进行一番梳理，期望可以为相关从业人员提供更加清晰的思路。
2016 年 9 月，广州燃石医学检验所有限公司（以下简称燃石）生产的“EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”作为中国首个肿瘤 NGS 检测产品进入“创新医疗器械特别审批程序”，经过近2年的时间，最终在2018年成功获得肿瘤 NGS 第一证，让整个测序行业为之振奋。该产品依托Illumina公司的MiSeqDx平台，采用RNA探针捕获技术检4种基因的13种变异，包括点突变、缺失及重排（融合）。其中EGFR基因19号外显子缺失（19del）、L858R点突变用于吉非替尼片和盐酸埃克替尼片伴随诊断检测，EGFR T790M点突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测，ALK重排（融合）用于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测。
得益于医疗器械注册审评的改革措施，从国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心（CMDE）公开的审评报告中，企业人员可以获悉监管部门对于肿瘤NGS伴随诊断产品的关注点以及要求。一般而言，针对此类产品，企业会在以下三个方面存在某种程度的困惑：第一，企业参考品和质控品的设置；第二，分析性能评估的内容；第三，伴随诊断临床研究。而这份报告也给出了相应的提示：
首先，对应性能指标设置企业参考品，包括阴性参考品、阳性参考品、重复性参考品和最低检出限参考品。参考品形式可以为临床肺癌组织样本，也可以为细胞系样本。参考品的验证选择数字PCR和Sanger两种方法。这里有两点笔者提醒大家注意，一是本次燃石申报的产品所涉及的变异位点并不多，或许是企业考虑到产品的伴随诊断临床意义以及监管的相关要求，因此其设置的各项企业参考品都覆盖了全部突变类型。然而，众所周知，NGS的特点是能够进行高深度、全面的基因测序，在这方面，FDA是具有批准肿瘤大panel的经验的，FDA前高级审查员Dr.Cheng Zhang就曾在2018年1月三亚举行的中美高通量测序高峰论坛上就向与会者分享过：“在NGS检测开发阶段，对于参考物质可以选择代表性的变异以覆盖不同类型的变异类型、变异大小以及基因组区域”。二是关于使用人造样本补充患者样本的情况，Dr.Cheng Zhang当时就建议过可进行样本可替换性研究。
其次，本次燃石提交的产品分析性能评估内容主要包括重复性试验、最低检出限试验、阴/阳性参考品符合率评估、分析特异性研究（干扰因素和交叉反应）、配套试剂盒的组合性能研究、肿瘤组织样本要求研究、不同规格试剂盒的分析性能验证。性能评估资料涉及两种规格的五批次产品，符合CMDE对于多批次（三批以上）性能评估的要求。而从FDA的监管经验以及已获批上市产品的安全有效数据综述（SSED）中可以看出，NGS检测常见的分析性能项目包括准确性、精密性、分析前准备如样本提取及样本质量等，灵敏度如空白限、检测限，DNA/RNA 投入量、组织投入量、肿瘤含量等，特异性如干扰物质和交叉反应，稳定性如样本稳定性、试剂稳定性、储存效期、上机稳定性、运输稳定性等，另外，有效阈值/系统稳定性也是其中一项。企业可以根据自身产品特点选择适宜的验证项目。而NGS检测实际上是一个系统，因此需要对整个检测系统进行验证，即从样本收集、样本制备到测序流程中的各个步骤，以及结果报告的生成。
最后，在伴随诊断临床研究部分，燃石采用了与已上市伴随诊断试剂盒进行比较研究以及TKI药物疗效相关的回顾性临床研究两种方式，这也与CMDE 发布的《EGFR突变基因检测试剂（PCR法）注册技术审查指导原则》中提及的有关突变基因个体化治疗相关临床研究要求相符。值得注意的是，由于回顾性研究中纳入的有效病例未完全符合统计学意义的要求，因此国家药品监督管理局（CNDA）对其作出了附加条件审批，即要求该产品上市后应继续对产品伴随诊断用途进行验证。
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紧随燃石的产品之后，2018年8月，CNDA通过创新医疗器械特别审批通道，批准了天津诺禾致源生物信息科技有限公司（以下简称诺禾）“人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）”上市。该产品覆盖与非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗用药相关的6个基因，包括点突变、插入缺失、融合等多种变异形式的检测。其中，EGFR基因19del、L858R点突变用于吉非替尼片伴随诊断检测（此一项燃石的产品所声称的靶向用药还包括盐酸埃克替尼片），T790M突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测，ALK融合和ROS1融合用于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测。此试剂盒选择了达安的DA8600基因测序仪作为适用平台，相信也是考虑到该平台已于2017年通过变更增加了“对人体基因位点的检测”，而反观燃石依托的是尚未获得CNDA批准的Illumina平台，率先突围的2项产品实际上也是Illumina和Life（Thermo Fisher）两大平台之争。从产品的主要组成我们也能看到平台之间技术路线的差异以及两家公司所选择的不同注册策略。
从公开文件可以了解到，诺禾采用的技术平台也是FDA批准的首个基于多生物标记物伴随诊断试剂盒OncomineTM Dx Target Test所适用的平台。诺禾的阳性参考品的设置同样采用了两种来源，包括临床样本和细胞系，而验证方法则选择了数字PCR和NGS。在分析性能评估方面，两项NGS产品在方法的选择上略有差异，并且由于技术原理不同，最终得出的分析灵敏度（检测限）也有较大差别。在临床评价部分，诺禾首选了Sanger测序来进行一致性的比较，样本总例数也达到2789例，可见其在产品临床验证上的投入。除此之外，考虑到Sanger测序本身的局限性，还选择了已上市qPCR试剂进行了部分比较研究，结果也是相当令人满意。在伴随诊断研究部分，同样的选择了Follow-on（与已上市伴随诊断试剂进行等效性研究）以及TKI药物疗效相关回顾性临床研究，从2项获批产品提供的数据可以看出，受制于阳性患者数量、临床样本可获得性等诸多因素，最终能够纳入回顾性研究的病例十分有限，很大程度上影响了审批，因此是否跟踪随访、与治疗药物共同开发会成为未来的发展趋势，我们将拭目以待。
随着监管部门开始认可肿瘤领域的NGS检测产品，除了上述已获批的两项产品，已进入“绿色通道”的其他同类产品，包括南京世和的肺癌靶向药物基因突变检测试剂盒（高通量测序法）、厦门艾德的人类癌症多基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）、厦门飞朔的人类肿瘤多基因变异检测试剂盒（半导体测序法）也正在审核过程中。相信随着更多的产品获得CNDA的批准，行业竞争也将在产品上市后激烈展开。不仅如此，为了进一步规范肿瘤相关突变基因检测产品的注册申报和技术审评， CMDE于8月14日发布了关于公开征求《肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则（征求意见稿）》意见的通知。体现出了监管部门对于NGS试剂盒产品的高度重视。
我们相信，NGS相关产品的丰富，将使得患者有更多选择获知罹患疾病的复杂性、治疗方案和预后，会为提高患者的治疗效果和生存质量提供更优质的服务。